肾髓质癌（RMC）是一种致命的恶性肿瘤，主要发生在非裔年轻人身上，此肿瘤对用于治疗其他肾细胞癌的所有靶向药物都具有耐药性。今天给大家带来的这项工作是来自CancerCell的ComprehensiveMolecularCharacterizationIdentifiesDistinctGenomicandImmuneHallmarksofRenalMedullaryCarcinoma一文，本文全面分析了多中心患者队列中先前未治疗过的原发性RMC肿瘤样本后发现RMC的特征是高复制应激和大量的拷贝数改变，这些改变与环状GMP-AMP合酶干扰素基因（cGAS-STING）先天免疫通路刺激子的激活有关。
Highlights分子特征能将肾髓质癌与其他肾脏恶性肿瘤区分
RMC有大量染色体的局部突变
RMC特有的免疫特征，cGAS-STING上调
DNAreplicationstress是RMC的一个特征
ResultsRMC和其它细胞癌突变形式不同
图1：RMC体细胞基因组改变
RMC在大多数的情况下（68.4%）发生在右肾，患者的平均年龄是28岁，73.7%的病人都是男性，65.8%的患者诊断时已经发生了转移，到了四期（图1）。单核苷酸变异率（SNVs）和插入和删除RMC的突变（inDels）非常低。31个未处理原发性肿瘤样本和15个匹配正常样本的全外显子组测序（WES）结果用于确定SNV和inDels，肿瘤组织的平均目标测序覆盖率为73倍，匹配正常组织的平均目标测序覆盖率为60倍，平均估计肿瘤纯度为49.1%（范围为24%-98%）。WES共鉴定了个基因中的个SNV和inDels（图1）。
对31个未治疗原发肿瘤样本中的5个样本进行临床靶向下一代测序（图1），未发现额外的SNV和inDels。RMC的低非同义突变载量与MRT相似（也表现为SMARCB1缺失），低于癌症基因组图谱测序的大多数肿瘤，包括其他肾细胞癌（图2A）。在31名未治疗的原发性RMC肿瘤的个基因中，只有22个已知的肿瘤抑制基因或癌基因被列在癌症体细胞突变目录（COSMIC）数据库中。另外10个基因被认为是与其他癌症类型相关的剪接因子。在31例（6.5%）RMC肿瘤中，有2例发生了SETD2突变，是RMC中唯一确定的发生改变的其他肾细胞癌基因驱动（图1）。
RMC的特征是8qGainandFocalChromosomalAlterations
图2:RMC的变异和拷贝数分布
SMARCB1位于22号染色体上，该染色体在40%的RMC中丢失（图2B）。除了22q11.23缺失外，RMC还存在复发性的局灶性染色体扩增和缺失（图2C，2D）。本文对先前发表的MRT和ATRT样本WES的分析显示，与RMC（图2D）相比，局灶性CNAs（图2E）要少得多。46.7%的RMC中发现染色体8q增加，而在RMC肿瘤中，根据RNA测序（RNA-seq），与相邻的正常肾脏相比，该染色体臂中有21.1%的基因显著上调（错误发现率[FDR]0.1）。没有发现其他复发性全染色体或臂染色体的增加或丢失，并且在所有RMC肿瘤中大约有一半（46.2%）是二倍体（图2C）。图2D显示了通过GISTIC分析量化的显著的拷贝数变化，包括SMARCB1位点及其周围的重复缺失（22q11.23）。利用先前发表的基因组坐标，本文发现RMC组织中32.5%的复发CNAs位于染色体脆弱位点，这表明这些改变不是随机分布在整个基因组中。作者还进行了GO分析，基因富集在了（图2）与组蛋白脱乙酰作用（p0.），脂质代谢和生物合成（p=0.），对铵离子和乙酰胆碱（p=0.），DNA转录（p=0.），和cytoskeleton-dependent胞质分裂（p=0.）上。
在RMC和横纹肌样肿瘤中，最常见的病灶缺失出现在SMARCB1位点22q11.23，与RMC相比，横纹肌样肿瘤中很少出现局灶性扩增（图2E），超过15%的横纹肌样肿瘤中没有发现局灶性扩增。
图3:SMARCB1丢失机制的综合表征
采用了荧光原位杂交（FISH），外显子组DNA测序（韦斯和有针对性的测序），和多路复用ligation-dependent探测器放大（MLPA）在未经处理的RMC肿瘤样本（图1、3b、3c和3d）。在38例RMC患者中发现了32例（84.2%）的SMARCB1基因丢失（图1）。最常见的分子改变，在38例中发现的20例（52.6%）是一个SMARCB1等位基因失活易位和第二个等位基因缺失。较少出现的是两个SMARCB1等位基因的缺失（38例患者中有6例;15.8%），1个SMARCB1等位基因缺失，2个SMARCB1等位基因缺失（38例中5例）;（13.2%），1个SMARCB1等位基因缺失，2个SMARCB1等位基因无义截断突变（38例中1例;2.6%）。这些结果与之前两项共对25例RMC患者进行的研究一致，这些研究发现，在25例（60%）患者中，有15例（60%）通过易位结合半合子缺失而失活，在25例（28%）患者中，有7例（28%）通过纯合子缺失而失活。此外，这种SMARCB1失活模式（失活易位结合半合子缺失）不仅发生在原发性肿瘤中，而且也分别发生在RMC38和RMC32患者的淋巴结和肝脏中。Sanger测序证实患者RMC32原发性肾肿瘤和肝转移中SMARCB1和MYOM1基因存在相同的易位（图3E和3F）。
转录组特征可以将RMC与其他肾恶性肿瘤区分开
图4：RMC转录组学特征与其他肾恶性肿瘤的区别
作者比较了11例未经治疗的原发性RMC肿瘤的蛋白编码和长非编码RNA（lncRNA）基因表达谱，以及发生于肾髓质或附近的其他恶性肿瘤:集管癌（CDC）和上呼吸道尿路上皮癌（UTUC）。如图4A的热图所示，RMC具有明显的特征，与CDC相比，与UTUC更接近（图4A）。在蛋白编码基因表达的无监管分析中，在CDC样本中聚集的RMC36T1样本（图4A）被证实为RMC，因为患者经血红蛋白电泳检测具有镰状细胞特征（图1），经免疫组化检测，SMARCB1肿瘤为阴性。与其他源自肾脏的癌症的进一步比较（图4B）再次证实了RMC与CDC关系最为密切，与肾脏MRT（第二常见的源自肾脏的smarcb1缺陷恶性肿瘤）明显不同。值得注意的是，所有5个肾细胞癌都形成了一个单独的簇状的肾MRT（图4B），这与癌肾MRT的不同形态表现相一致。
尽管RMC与肾脏MRT具有共同的肾脏起源和SMARCB1失活的共同病因，但RMC与肾脏MRT不同的基因表达谱，促使作者探索这些恶性肿瘤的肾元起源部位。使用外部正常组织的基因表达数据集microdissected从各种肾元区域，RMC的基因表达谱，疾控中心，透明细胞肾细胞癌（ccRCC），乳头状肾细胞癌（PRCC）Chromophobe肾细胞癌（ChRCC）和肾脏捷运被监督全球比较分析与肾元图集中的每个样本（图4c）。RMCmRNA表达了与收集管高度的相关性，这也是公认的站点的起源中心，而没有相关性的转录组肾脏捷运和收集管，这表明RMC和肾脏捷运有不同的起源在肾元（图4c）。正如预期的那样，ccRCC和PRCC的转录组表明起源于肾元的更近端（皮层）区域。
与正常肾脏相比，RMC中与复制应激和先天免疫应答相关的基因显著上调（图4D）。GSEA分析证实了这一点，该分析显示，与相邻的正常肾脏相比，未治疗的原发性RMC的生物通路中，参与炎症/免疫反应、DNA修复和c-MYC信号转导的基因富集。几个代谢通路在RMC中下调，图4E显示了RMC与相邻正常肾脏相比改变的单个基因的代谢通路图。RMC中与三羧酸（TCA）循环和氧化磷酸化相关的基因减少，而与脂肪酸合成相关的基因增加。有趣的是，考虑到肾髓质的低氧特性，RMC显示了与低氧和低氧诱导的EMT相关基因的表达增加（图4F）。
除了蛋白编码基因外，还在RMC和正常肾脏中发现了差异表达的lncrna。上调，lncRNA最高的是尿路上皮癌相关（UCA1）。UCA1在移行细胞癌中也显著上调，以前被认为对移行细胞癌具有高度特异性。RMC肿瘤中的UCA1水平与UTUC相似，显著高于CDC或其他肾脏癌。另外四个先前被证明与癌症相关的lncrna在RMC中上调：GAS5、HOTAIR、PVT1和H19。在RMC中上调的5个癌症相关lncrna的基因组位点没有发现拷贝数增加。
RMC具有不同的免疫特征
图5：RMC有明显的免疫特性
RMC的炎症/免疫反应基因表达特征使作者下一步确定了这些肿瘤的免疫细胞浸润。对组织浸润免疫和间质群体的反褶积显示RMC中有大量成纤维细胞（图5A），这与该肿瘤显著的间质纤维组织增生特征一致。与ccRCC相比，RMC的内皮细胞较少（图5A），这与ccRCC中vonHippel-Lindau缺失导致的明显的血管生成相一致。
与ccRCC相比，RMC含有同样高数量的T细胞和细胞毒性淋巴细胞（图5A），ccRCC是一种已知易受免疫检查点治疗影响的肾恶性肿瘤。与ccRCC相比，RMC肿瘤有大量的髓样树突细胞、中性粒细胞和B系细胞（图5A）。免疫抑制可涉及多个免疫检查点，其中许多在RMC组织中被发现上调，免疫检查点受体如PD-1、CTLA-4和LAG3的表达增加（图5B）。包含IHC作者验证这些转录组的发现，证实了RMC组织含有高水平的CD3+T细胞淋巴细胞，辅助T细胞CD4+，CD8+细胞毒性T细胞，FOXP3+调节性T细胞，CD68+巨噬细胞，CD20+B细胞淋巴细胞，和PD-1免疫检查点，而PD-L1免疫的染色模式异构一些检查点RMC肿瘤证明增加PD-L1表达对肿瘤细胞和免疫细胞周围（图5c）。
局灶性CNAs如缺失、重复和易位与细胞内DNA泄漏增加有关，导致干扰素基因环状GMP-AMP合酶刺激因子（cGAS-STING）细胞内双链DNA感应抗病毒先天免疫通路上调。CDC也有多个复发性CNAs，cGAS和STING基因表达水平相似。此外，与肾MRT（一种染色体更稳定的疾病）相比（图2E），RMC表达明显更高的STINGmRNA水平（增加4.2倍，FDR0.），胞质DNA检测和先天免疫通路富集。免疫组化证实RMC中细胞质STING的存在明显高于邻近的正常肾脏和肾脏MRT组织（图5D和5E）。
DNAReplicationStress是RMC的标志
图6：SMARCB1缺失促进MYC诱导的复制应激
已知SWI/SNF复合物中的SMARCB1通过直接与c-MYC靶基因启动子相互作用拮抗c-MYC功能。研究者的GSEA分析显示，smarcb1缺陷的RMC组织显示与细胞周期进展和DNA复制和修复相关的多个hallmark通路的富集，包括G2-M检查点、c-MYC和E2F靶基因，以及TP53和DNA修复通路，这与这些具有复制应激表型的肿瘤一致。此外，在复制应激引发的ATR（ataxia毛细血管扩张-和rad3相关）DNA损伤修复通路的激活下，RMC肿瘤显示出上调基因表达的富集（图6A）。此外，作者发现，与RMC（smarcb1阴性）肿瘤相比，RMC（smarcb1阳性）肿瘤中myc诱导复制应激相关的基因集上调（图6B,6C）。
在RMC的突变图中，注意到大多数RMC肿瘤中最常见的替代是CT转变（图1），这与胞嘧啶脱胺过程有关，通常与年龄或DNA复制应激有关。然而，患者年龄与CT突变的数量并没有很强的相关性（Spearmanrankcorrelation=0.，p=0.），提示它们是在细胞周转率高的环境下由复制应激引起的。此外，RMC肿瘤中主要的突变特征模式是特征1，主要包括CpG二核苷酸基序上的CT转变，已知与年龄和/或高数量的核分裂相关。然而，在本文的RMC样本中，患者年龄和特征1之间没有相关性（Spearman秩相关=0.，p=0.）。因此，RMC的基因组图谱显示了与复制胁迫兼容的突变模式。
SMARCB1缺失促进MYC诱导的复制应激
作者研究了先前发表的c-MYC的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据，发现在GMRT细胞中，由TET诱导的SMARCB1的重新表达导致与复制胁迫相关的基因启动子区域的峰显著降低（FDR0.05）（图6F）。smarcb1-阴性的G细胞在与细胞周期进展和DNA复制和修复相关的多个标记通路相关的基因启动子区域显示c-MYC富集。同样，作者发现SMARCB1在RMC2C细胞中的重新表达导致与细胞周期进展和DNA复制相关的基因启动子处c-MYC富集显著减少（图6G）。作者进行了DNA纤维分析，以直接探索SMARCB1损失对DNA复制叉动力学的影响。SMARCB1基因敲除显著加速了复制叉进程（图6H），这是复制应激和相关DDR的一般机制。总的来说，本文的研究结果表明，SMARCB1缺失增加了c-MYC与与DNA复制和细胞周期进程相关的下游基因启动子的结合，并通过增加复制叉进程的速度从而导致DDR通路的上调，从而诱发复制应激。
RMC容易受到针对复制压力设计的药物的影响
图7：RMC在体内外易受靶向复制应激药物的影响
具有高度复制应激的肿瘤依赖完整的DDR通路生存。作者推断，由于这种依赖性，像RMC这样的smarcb1阴性肿瘤将容易被直接靶向DDR途径（如PARP和ATR途径），或靶向细胞周期调节因子（如抑制复制应激的WEE1激酶）。第一次查询药物敏感性癌症的基因组学数据库（7.0版），发现了olaparibPARP抑制剂，临床上被批准用于乳腺癌和卵巢癌，诱发更强有力的抗增殖反应。在体外使用两种单独的PARP抑制剂（olaparib和niraparib）证实，与三种smarcb1阳性的肾细胞癌细胞系相比，smarcb1阴性细胞系对PARP通路靶向敏感（图7A）。
作者还发现，smarcb1阴性细胞系对ATR抑制剂VX和AZD以及WEE1抑制剂adavosertib敏感（图7B）。挽救SMARCB1或直接抑制c-MYC逆转了SMARCB1阴性细胞对PARP、ATR和WEE1抑制剂的敏感性（图7C和7D）。总的来说，这些数据表明，SMARCB1丢失使癌细胞对DDR和细胞周期检查点途径的药理学干扰敏感。铂盐敏感性如顺铂和卡铂、DNA合成抑制剂，如吉西他滨和拓扑异构酶抑制剂，如阿霉素代表肿瘤的特征复制水平较高的压力，因为这些药物可以引起或增强DNA损伤，可以压倒DDR通路，从而导致不可逾越的基因组不稳定性和细胞死亡。
为了研究靶向DDR通路在RMC中的体内抗肿瘤作用，作者使用了一名RMC男性患者的未治疗原发肿瘤样本（RMC2T）生成的皮下患者源性异种移植瘤（PDX）模型（RMC2X）。RMC2X肿瘤小鼠（每组5只;治疗开始时的平均肿瘤体积为mm3）被随机分配了niraparib、AZD、niraparib联合AZD或vehiclecontrol共计25天。对照组的一只小鼠在治疗开始后的第8天死亡，而三个治疗组的所有小鼠在治疗结束时都活着。如图7E所示，niraparib治疗组肿瘤体积明显低于vehicle对照组（p=0.）。相反，与对照剂相比，AZD并没有显著降低肿瘤体积（p=0.54），与niraparib联合治疗也没有比niraparib单独治疗产生更强的抗肿瘤作用（p=0.）。这些发现表明，在RMC中单独靶向PARP通路或联合铂化疗具有潜在的治疗价值。
Discussion与MRT和ATRT中发现的少量病灶CNAs相比，作者发现RMC具有更复杂的基因组，约有三分之一的病灶CNAs映射到染色体脆弱位点。这与之前提出的RMC发病机制的假设模型一致。作者发现，携带SMARCB1的22号染色体的一个副本在超过三分之一的RMC肿瘤中丢失。在大约一半的RMC组织中观察到的另一种复发的arm水平CNA是c-MYC基因所在位置的8q增益。发现RMC肿瘤在与细胞增殖相关的基因区域含有复发性局灶性CNAs，包括一种导致Notch通路激活的独特CNA模式，该模式也存在于BLCA的基础亚型中。
作者发现，RMC和CDC之间的一个显著区别是，与CDC相比，RMC中的SMARCB1缺失激活c-MYC通路，随后引发高水平的DNA复制应激，导致DDR和细胞周期检查点通路上调。与具有更简单基因组的smarcb1阴性恶性肿瘤（如MRT和ATRT）相比，RMC中染色体改变的丰富程度可能使其对利用复制应激的疗法更敏感。SMARCB1缺失背景下异常的c-MYC活性也会上调未展开蛋白反应，从而使细胞对诱导蛋白毒性应激的药物敏感。
作者：张若贤
原文引用：doi:10./j.ccell..04.
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